Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型VP60蛋白重组腺病毒的构建及鉴定

[目的]试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体,构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒,为RHDV2新型疫苗研究提供依据.[方法]修饰、合成带有Kozak序列的VP60基因序列,将其与腺病毒穿梭质粒进行重组,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,构建重组腺病毒穿梭质粒,并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定;采用Ad Max腺病毒包装系统,基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组,构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞,通过RT-PCR,Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证;利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度.[结果]重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3 895和1 752 bp的条带,测序比对结果显示,其与GenBank中公布的相应序列相似性＞99％,表明穿梭质粒构建成功.RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带;Western blotting结果显示,大小约为60 ku的VP60蛋白特异性条带;IFA观察结果显示,感染重组腺病毒的HEK293细胞产生了绿色荧光,表明重组病毒能在HEK293细胞中表达VP60蛋白,且该蛋白具有良好的抗原性;病毒滴度测定结果显示,初代重组腺病毒的TCID50为105-5/0.1 mL.[结论]本试验构建了含RHDV2 VP60基因的重组腺病毒,并成功表达了 RHDV2 VP60蛋白,为进一步研究开发RHDV2疫苗提供了病毒模型.