miR-302d的载体构建及其与Tle4基因的靶向关系验证

试验旨在探究精原干细胞(SSCs)形成过程中的关键miR-302d行使功能的分子机制.试验克隆miR-302d 前体序列并连入PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro 构建miR-302d过表达载体(miR-302d mimics);合成miR-302d的干扰靶点并连入PGMLV-SC5载体构建miR-302d干扰载体(miR-302d inhibitor).通过生物信息预测获得miR-302d靶基因并构建其3'UTR的野生型(WT)和突变型载体(MT);将miR-302d过表达载体分别与WT和MT载体共转染DF-1和293T细胞,检测靶基因3'UTR的活性.同时检测在DF-1细胞中过表达或干扰miR-302d后靶基因的表达变化.结果显示:成功构建miR-302d的过表达和干扰载体;预测结果显示Tle4为miR-302d的潜在靶基因,且该基因为ESCs分化为SSCs过程的重要基因;双荧光素酶活性检测结果显示不论是在DF-1还是293T细胞中,与转染WT+miR-NC组相比,转染WT+miR-302d组的双荧光素酶活性显著下降(P＜0.05),而共转染MT+miR-302d组的荧光素酶活性差异不显著(P＞0.05),且过表达miR-302d后下调Tle4的表达,而干扰miR-302d后上调Tle4的表达.结果表明,miR-302d可直接调节靶基因Tle4的表达.