朝鲜淫羊藿ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究采用L16(43)正交试验设计,优化了朝鲜淫羊藿ISSR-PCR反应体系中的模板DNA加入量、引物加入量、2×TaqMaster Mix加入量3个参数,建立了最佳反应体系.采用优化后的反应体系,从100条ISSR引物中筛选出7条多态性引物,并对每条引物的退火温度逐个优化.试验结果表明朝鲜淫羊蕾ISSR-PCR 最佳反应体系为:3 μL 模板 DNA(8.7 ng/μL),3.5 μL 引物(2.5 μmol/L),12μL2×Taq Master Mix,双蒸水补足至体积为20 μL.PCR扩增步骤:在94℃条件下先预变性4 min,后变性1 min,于57℃退火,72℃延伸均进行40 s,共循环35次,然后于72℃下补齐5 min,产物保存在4℃冰箱.经验证表明该反应体系稳定,引物条带清晰且多态性良好,该研究为朝鲜淫羊藿的群体遗传学研究奠定了前期基础.