小鼠miR-155基因启动子分析及转录活性鉴定

目的:鉴定小鼠miR-155 基因启动子转录活性区域,预测转录因子结合位点,探讨miR-155 在巨噬细胞极化中表达失调的转录调控机制.方法:分别构建小鼠miR-155 基因表达质粒和miR-155 基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体.将miR-155 表达载体与miR-155 启动子荧光素酶报告载体瞬时共转染人胚肾上皮细胞293T,48 h后检测双荧光素酶活性.选取miR-155 基因转录起始位点(TSS)上游2000 nt作为启动子区,生物信息学预测该区域可能结合的转录因子,并在体外极化的M1 型和M2 型巨噬细胞中检测结合的相关转录因子的表达.结果:成功构建小鼠miR-155 基因表达质粒和miR-155 基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体.双荧光素酶试验结果显示,小鼠miR-155 基因TSS上游 1～500 nt、1～1000 nt及1～2000 nt片段均存在转录激活作用,提示小鼠miR-155 基因TSS上游 1～2000 nt均为miR-155 基因的启动子区域,其中1～500 nt为启动子核心区域.转录因子的生物信息学预测结果显示,miR-155 基因TSS上游1～2000 nt的序列存在Crp、Pax-6、Elf-1、Gata-1、Hnf-4、BR-C Z4 等转录因子结合位点.RT-qPCR结果显示,转录因子中结合分数最高的Crp、Pax-6、Elf-1 和Gata-1 均在M1 型巨噬细胞中低表达,与miR-155 的表达方式相反.结论:小鼠miR-155 基因TSS上游 1～2000 nt均为启动子区域,其中1～500 nt为转录核心区域.转录因子Crp、Pax-6、Elf-1 和Gata-1 均与miR-155 基因启动子区域结合,并负调控miR-155 的转录.