秦川牛LRRN1基因表达分析及其对成肌细胞增殖分化的影响

富亮氨酸重复序列神经元蛋白-1基因(leucine rich repeat neuronal protein-1,LRRN1)编码一种Ⅰ型跨膜蛋白,在神经发育与再生进程中发挥重要作用.牛成肌细胞的增殖分化直接影响其肌肉的生长发育,从而影响牛肉的产量.本研究旨在探究LRRN1基因在秦川牛(Bos taurus)不同组织中的表达规律及其对牛成肌细胞增殖分化的影响,以确定其在成肌分化中的主要作用.首先采用qRT-PCR技术检测LRRN1在新生(3日龄)和成年(24月龄)秦川牛不同组织中的表达规律,及其在体外培养的牛骨骼肌成肌细胞不同分化时期的表达特性;利用腺病毒介导的shRNA和pcDNA3.1(+)构建LRRN1基因干扰和过表达载体,转染秦川牛成肌细胞,采用EdU法检测细胞增殖,通过qRT-PCR和Western blot检测增殖标志分子的表达变化;经成肌诱导分化培养基作用后,观察肌管形成表型并检测分化标志分子的表达变化.结果显示,LRRN1在秦川牛各组织中广泛表达,在新生牛和成年牛肾脏和背最长肌中高表达;LRRN1基因表达在成肌分化过程中先升高、后降低,在分化4d达到峰值,此后逐渐降低,与成肌细胞的体外分化进程具有相同的变化趋势.在成肌细胞中干扰LRRN1基因表达,结果显示,EdU染色的增殖细胞占比显著减少(P＜0.05),增殖标志基因CCNA2(P＜0.01)、CCNB1(P＜0.05)、PCNA(P＜0.01)、CCND2(P＜0.05)和CDK1(P＜0.05)下调表达,CCND2、CDK1、CCNB1和PCNA蛋白表达量也降低;LRRN1过表达也显著抑制成肌细胞增殖(P＜0.05),CCNA2(P＜0.05)、CCNB1(P＜0.01)、PCNA(P＜0.01)和CCNE2(P＜0.05)基因表达被抑制,CCNB1、PCNA与CDK1的蛋白表达量也降低.对细胞分化表型进行观察,发现LRRN1干扰抑制肌管形成,抑制分化标志基因MYOG(P＜0.01)、MYF5(P＜0.01)、MYF6(P＜0.01)、MYH3(P＜0.01)和CKM(P＜0.05)的表达,MYOG、MYF5和MYH3的蛋白表达量也降低;LRRN1过表达则促进肌管形成,MYH3(P＜0.01)、MYOD(P＜0.05)、MYF5(P＜0.05)和MYF6(P＜0.05)的基因表达量显著升高,MYOD和MYH3的蛋白表达量也增加.上述结果提示,LRRN1是成肌细胞分化的正向调节因子,但是对成肌细胞增殖的作用尚需更全面和深入的研究.因此,LRRN1对秦川牛肌肉组织的生长发育具有潜在的调控作用,对其深入的功能研究可用于秦川牛的分子育种实践.