非洲猪瘟病毒一步法巢式锁核酸荧光定量PCR方法的建立

试验基于非洲猪瘟病毒(Africanswine fevervirus,ASFV)B646L(P72)蛋白基因序列,建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法.采用Oligo7软件设计一步法巢式锁核酸荧光定量PCR(One Step Nested-Locked Nucleic Acid real-time PCR,LNA-OSN-PCR)的嵌套引物以及探针,并对外引物进行锁核酸修饰.建立并优化LNA-OSN-PCR反应体系和条件,确立LNA-OSN-PCR标准曲线,并检验LNA-OSN-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性.采用LNA-OSN-PCR方法,对96份临床疑似患病样品进行检测,同时与普通荧光探针PCR方法进行比较.试验确立并优化了 LNA-OSN-PCR的反应条件和体系,建立的LNA-OSN-PCR标准曲线,具有较好的线性(R2=0.9945).该方法的最低检测限为3×10-1 copies/μL,变异系数小于3％,并且与其他病毒或细菌核酸无交叉反应.LNA-OSN-PCR方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法比较,检测灵敏度提高10～100倍,在对96份临床疑似患病核酸样品进行检测中,检出55份阳性,41份阴性,比常规的荧光定量PCR具有更高的阳性检出率.并且能获得典型的扩增曲线.试验结合一步法巢式PCR和锁核酸修饰,建立了 ASFV一步法巢式锁核酸荧光定量PCR,为检测ASFV提供一种高灵敏度和高特异性且经济实惠的检测方法.