发菜盐胁迫响应基因蔗糖合成酶S1的克隆及原核表达

利用高通量转录组测序(RNA-Seq)技术对不同盐浓度胁迫下的发菜样本比对分析,从发菜盐胁迫差异表达基因中筛选蔗糖合成酶S1基因,以发菜基因组为模板,克隆蔗糖合成酶S1基因完整片段并进行生物信息学分析,将目的基因导入大肠杆菌初步表达,以此进一步优化目的蛋白表达条件.该研究通过设计特异性引物成功克隆出片段大小为2409 bp的蔗糖合成酶S1基因.生物信息学分析表明,蔗糖合成酶S1蛋白平均分子质量为92.85 kDa,为亲水性蛋白且保守性高,理论等电点为5.52,不含跨膜区.该蛋白氨基酸序列中含有37个Ser磷酸化位点、13个Thr磷酸化位点、8个Tyr磷酸化位点,其二级结构主要为α螺旋和随机卷曲.纯化回收体外扩增得到的目的基因,连接质粒pETsumo,构建表达载体pETsumo-S1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,获得预期大小的外源蛋白.优化表达条件可知当菌液OD600值达到0.8时添加终浓度为0.05 mmol/L的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG),37℃、200 r/min条件下诱导6 h目的蛋白表达量最高.研究结果丰富了发菜盐胁迫响应基因的研究,为发菜基因簇、基因调控位点等研究奠定基础,对于从分子层面阐明发菜响应盐胁迫的调控机制具有重要意义.