荧光重组酶聚合酶扩增技术快速检测田鼠巴贝虫方法建立及初步评价

目的 建立一类荧光重组酶聚合酶(recombinase polymerase amplification,RPA)扩增的田鼠巴贝虫快速检测方法并对该方法进行评价.方法 选择细胞色素B基因为靶序列,设计3组引物及荧光探针建立田鼠巴贝虫的检测方法并优化引物.设置37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃等6个温度梯度进行反应温度条件优化.将基因组DNA稀释至1 ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL等7个浓度梯度进行该方法的敏感性评价,采集恶性疟及间日疟患者血液样本进行特异性评价.取445 200、89 040、17 808、3 561.6、712.32、142.46、28.49、5.7、1.14、0.23不同田鼠巴贝虫载量的样本进行虫密度最低检测限实验.选取16例临床发热患者的血液样本进行荧光RPA与巢式PCR检测,评价结果一致性.结果 建立的荧光RPA法可特异扩增出150bp的田鼠巴贝虫目的片段,最佳反应温度为39℃.该方法针对基因组DNA的检测敏感性最低可达10fg/μL,不同田鼠巴贝虫密度样本的最低检测限量为0.23个/μL.该方法在对恶性疟、间日疟患者血液样本的检测中均未出现交叉反应.荧光RPA与巢式PCR各检测16例临床发热患者血液样本,均检出9例田鼠巴贝虫阳性,7例田鼠巴贝虫阴性,结果一致.结论 荧光重组酶聚合酶扩增检测田鼠巴贝虫方法敏感性强、特异性好,有望应用于巴贝虫感染的快速检测及风险监测.