八宝丹抑制TNF-α诱导C2C12成肌细胞Atrogin-1表达的研究

目的 研究八宝丹(BBD)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的C2C12成肌细胞中核因子κB(NF-κB)通路及下游通路UPS系统中萎缩相关基因1(Atrogin-1)的作用.方法 ① 筛选BBD干预浓度实验:取对数生长期C2C12成肌细胞分别予0、0.125、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL不同浓度BBD干预48 h,采用MTT法检测细胞活力;② 筛选TNF-α刺激细胞的浓度和时间实验:取对数生长期C2C12成肌细胞,分别予0、1、10、50 ng/mL TNF-α蛋白液刺激C2C12成肌细胞,Western blot法检测p-P65、Atrogin-1蛋白表达以筛选出TNF-α刺激细胞的最佳浓度;再根据TNF-α刺激细胞的最佳浓度干预C2C12成肌细胞0 min、8 min、15 min、30 min、1 h、4 h,West?ern blot法检测p-P65、Atrogin-1蛋白筛选出TNF-α刺激细胞的最佳时间;③BBD干预实验:将C2C12成肌细胞随机分为空白对照组、药物对照组、模型组、八宝丹组,药物对照组和八宝丹组分别加入BBD预处理2 h,再根据筛选的TNF-α刺激细胞最佳浓度和时间,于模型组和八宝丹组中加入TNF-α刺激细胞,Western blot法检测p-P65、Atrogin-1的蛋白表达水平.结果 ①筛选BBD干预浓度实验结果表明,不同浓度BBD对C2C12成肌细胞活力无影响(P>0.05),根据本课题组前期研究结果,最终选取0.75 mg/mL作为BBD干预细胞浓度;②筛选TNF-α刺激细胞的浓度和时间实验结果表明,10 ng/mL TNF-α刺激C2C12成肌细胞8 min后p-P65蛋白表达明显升高(P<0.05),10 ng/mL TNF-α刺激C2C12成肌细胞4 h后Atrogin-1蛋白表达水平明显升高(P<0.01);③BBD干预实验结果表明,与空白对照组比较,模型组p-P65、Atrogin-1蛋白表达显著上调(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,八宝丹组p-P65、Atrogin-1蛋白表达显著下调(P<0.05,P<0.01).结论 BBD可抑制TNF-α诱导的NF-κB信号通路中NF-κB的磷酸化水平及下游通路Atrogin-1蛋白表达.