STAG2基因敲除的IPEC-J2细胞系构建及其对PDCoV复制影响的研究

为探究猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)中基质抗原2(STAG2)因子对猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)复制的影响,本研究针对STAG2基因设计并合成sgRNA,将其克隆至lentiCRISPR v2载体构建重组表达质粒.将重组质粒转染至IPEC-J2细胞后,利用嘌吟霉素(Puromycin)采用有限稀释法进行亚克隆,筛选STAG2基因缺失的单克隆细胞株,并经western blot鉴定后最终获得一株STAG2缺失的单克隆稳定细胞系IPEC-J2-STAG2-/-(KO).利用western blot方法鉴定不同代次STAG2敲除细胞的遗传稳定性,结果显示,IPEC-J2-STAG2-/-细胞具有良好的遗传稳定性.为探究STAG2基因对PDCoV复制的影响,本研究将PDCoV分别感染IPEC-J2-STAG2-/-细胞和野生型IPEC-J2细胞(WT),采用荧光定量PCR、western blot方法检测细胞中PDCoV N基因mRNA转录及其蛋白表达水平.结果显示,与WT组相比,IPEC-J2-STAG2-/-细胞中PDCoV N基因mRNA转录水平及其蛋白表达水平均极显著降低(P＜0.01),表明STAG2缺失会抑制PDCoV在IPEC-J2细胞中的复制.为探究STAG2缺失是否刺激宿主细胞产生天然免疫应答,本研究利用荧光定量PCR方法检测敲除细胞中3种天然免疫应答相关干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平,结果显示,与WT相比,IPEC-J2-STAG2-/-细胞内相关ISGs转录水平显著升高(P＜0.01),表明STAG2缺失后宿主细胞启动天然免疫应答进而抑制PDCoV的复制.本研究首次发现STAG2基因缺失后显著上调了 IPEC-J2细胞天然免疫抗病毒基因的转录水平,从而抑制PDCoV的复制,为研究PDCoV和宿主因子相互作用提供了新思路.