六味地黄方含药血清对H2O2诱导的氧化损伤MC3T3-E1细胞的干预作用

目的 观察六味地黄方含药血清对H2O2诱导的氧化损伤小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)增殖、分化、矿化的干预作用,并从无翅型MMTV整合位点家族成员/β-连环蛋白(Wnt/β-Catenin)、护骨素/核因子-κB受体活化因子配体(OPG/RANKL)通路及线粒体凋亡途径初步探讨其作用机制.方法 制作六味地黄方汤剂,对成年Wistar大鼠进行灌胃,获取六味地黄方含药血清.将MC3T3-E1细胞分为正常组、模型组、N-乙酰半胱氨酸(NAC)组、对照含药血清组、低剂量含药血清组、中剂量含药血清组及高剂量含药血清组.除正常组外,其余各组先用1.0 mmol/L过氧化氢(H2O2)预处理MC3T3-E1细胞6 h,随后模型组更换为正常培养基,NAC组更换为含有2.5 mmol/L NAC的培养基,药物血清组更换为含有10％药物血清的培养基,各组均处理24 h,然后根据检测指标的不同给予进一步处理.采用CCK-8法检测培养24h、48h、72h后MC3T3-E1细胞的增殖情况,诱导培养7 d后检测碱性磷酸酶(ALP)活性,21 d后通过茜素红染色检测矿化结节.采用RT-PCR检测以下通路中关键基因表达:Wnt/β-Catenin基因通路中Wnt2、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Lrp5)、β-Catenin mRNA表达;OPG/RANKL通路中OPG、RANKL mRNA表达,计算OPG/RANKL比值;线粒体凋亡途径中B细胞淋巴瘤2(Bcl-2),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)mRNA表达.结果 与正常组比较,模型组细胞增殖、ALP活性均降低(P＜0.01),矿化结节数量减少;Wnt/β-Catenin 基因通路中 Wnt2、Lrp5、β-Catenin mRNA 表达降低(P＜0.01);在 OPG/RANKL 通路中OPG mRNA表达降低,RANKL mRNA表达升高,OPG/RANKL比值降低(P＜0.01);在线粒体凋亡途径中,Bcl-2 mRNA表达降低,Caspase-9、Caspase3 mRNA表达升高(P＜0.01).与模型组比较,六味地黄方含药血清各剂量组在24 h、48 h、72 h均能促进MC3T3-E1细胞增殖(P＜0.01),促进ALP活性(P＜0.05,P＜0.01),增加矿化结节数量.在Wnt/β-Catenin基因通路中,与模型组相比,除低剂量含药血清组外,中、高剂量含药血清组Wnt2 mRNA表达均高于模型组(P＜0.01).六味地黄方含药血清各剂量组Lrp5 mRNA表达均高于模型组(P＜0.01),β-CateninmRNA表达亦高于模型组(P＜0.05,P＜0.01).在OPG/RANKL基因通路中,除低剂量含药血清组外,中、高剂量含药血清组OPG mRNA表达均高于模型组(P＜0.05,P＜0.01),RANKL表达均低于模型组(P＜0.01),但含药血清各剂量组OPG/RANKL比值均高于模型组(P＜0.01),并呈剂量依赖性升高.在线粒体凋亡途径中,含药血清各剂量组Bcl-2 mRNA表达均高于模型组(P＜0.05,P＜0.01),Caspase-9、Caspase-3 mRNA表达均低于模型组(P＜0.01).结论 六味地黄方含药血清可以降低H2O2对MC3T3-E1细胞的损伤,促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化、矿化,其保护作用可能与调控Wnt/β-catenin信号通路、OPG/RANKL、线粒体凋亡途径中的关键靶点有关.