刚地弓形虫慢性感染小鼠脑组织中lncRNA102796的差异表达及其作用机制

目的 了解长链非编码RNA102796(lncRNA102796)在刚地弓形虫慢性感染小鼠脑组织中的差异表达及其作用机制.方法 取SPF级雌性BALB/c小鼠构建弓形虫慢性感染小鼠模型.感染后2个月,取感染小鼠(10只)和健康对照小鼠(10只)脑组织,提取总RNA以及神经细胞的细胞质和细胞核RNA,采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测小鼠脑组织中lncRNA102796的表达和在神经细胞中的定位.生物信息学分析预测lncRNA102796的靶基因为阿片受体1(opioid receptor delta 1,oprd1)基因.取感染小鼠和健康对照小鼠脑组织,提取总RNA和细胞蛋白,qRT-PCR检测脑组织中oprd1 mRNA相对转录水平,蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测脑组织中OPRD1的表达情况.构建lncRNA102796的干扰质粒(干扰lncRNA102796)和过表达质粒(过表达lncRNA102796),分别以未干扰lncRNA102796的质粒pGPU6/GFP/Neo和未过表达lncRNA102796的质粒pcDNA3.1+为干扰对照和过表达对照.将质粒转染至神经小胶质细胞(BV-2),提取细胞内RNA,qRT-PCR检测lncRNA102796的干扰和过表达对oprd1 mRNA相对转录水平的影响;提取蛋白质,Western blotting检测lncRNA102796的干扰和过表达对OPRD1表达的影响.取干扰和过表达质粒及2种对照质粒转染后的BV-2细胞,细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测lncRNA102796对细胞增殖的调节作用.构建过表达正义和过表达反义lncRNA102796质粒,提取2种质粒转染的BV-2细胞的RNA和蛋白质,RNA-蛋白沉降(RNA pull down)和Western blotting分析与lncRNA102796结合的蛋白.结果 qRT-PCR检测结果显示,弓形虫慢性感染小鼠脑组织中lncRNA102796相对转录水平为0.303±0.054,较健康小鼠下调(69.7±6.7)％(t=18.12,P<0.05);lncRNA102796在细胞核内的表达[(85.04±9.41)％]高于细胞质[(14.95±9.41)％](t=7.45,P<0.05).qRT-PCR检测结果显示,感染小鼠脑组织中oprd1 mRNA相对转录水平为0.170±0.040,较健康对照小鼠下调了(83.0±5.3)％(t=27.17,P<0.05);Western blotting检测结果显示,感染小鼠脑组织中的OPRD1蛋白表达量较健康对照小鼠减少.干扰lncRNA102796后,lncRNA102796相对转录水平为0.311±0.054,较对照组下调了(68.9±6.6)％(t=18.00,P<0.05),oprd1 mRNA相对转录水平为0.175±0.040,较对照组下调(82.5±5.1)％(t=28.08,P<0.05),OPRD1蛋白的表达量较对照组减少;过表达lncRNA102796后,lncRNA102796相对转录水平为8.220±1.192,较对照组上调(722.0±146.0)％(t=8.56,P<0.05),oprd1 mRNA相对转录水平为2.533±0.365,较对照组上调(153.3±44.7)％(t=5.95,P<0.05),OPRD1蛋白表达量较对照组增加.CCK-8实验结果显示,干扰lncRNA102796可抑制神经小胶质细胞的增殖,培养48和72 h后,A450值分别为0.272±0.021、0.508±0.014,低于对照组的0.473±0.024、0.816±0.014(t=6.35、46.77,P<0.05);过表达lncRNA102796可促进小胶质细胞的增殖,培养48、72 h后,A450值分别为0.621±0.038、1.026±0.114,高于对照组的0.365±0.010、0.530±0.147(t=10.55、5.17,P<0.05).RNA pull down后,经Western blotting检测结果显示,OPRD1可以与lncRNA102796结合.结论 在弓形虫慢性感染的小鼠脑组织中,lncRNA102796通过与靶基因oprd1结合抑制小胶质细胞的增殖,影响细胞周期,从而导致神经细胞的损伤.