VSMC-Cx43-/-条件性基因敲除小鼠模型的构建及基因型鉴定

目的 应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统构建血管平滑肌缝隙连接蛋白Cx43条件性基因敲除小鼠(VSMC-Cx43-/-)模型.方法 采用受精卵同源重组的方式,对Gja1基因进行flox修饰.通过体外转录的方式,获得Cas9 mRNA和gRNA;通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体,该载体包含3.0 kb 5'同源臂、1.9 kb的flox区域和3.0 kb 3'同源臂.将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,获得F0代小鼠.PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得3只阳性F1代小鼠(Cx43flox/+).将获得的flox杂合子Cx43flox/+小鼠自交,获得flox纯合子Cx43flox/flox小鼠.然后用Cx43flox/flox小鼠和Myh11-CreERT2小鼠交配,最终获得flox纯合且Cre阳性的实验组小鼠(该小鼠简写为:VSMC-Cx43-/-)和flox纯合且Cre阴性的对照组小鼠(Cx43flox/flox).用PCR进行基因型鉴定,用Western blot技术检测Cx43在大脑中动脉、冠脉、肺动脉和肾动脉组织中的表达,以明确基因敲除小鼠是否构建成功.结果 基因型鉴定、免疫荧光和Western blot检测结果表明VSMC-Cx43-/-基因敲除小鼠模型构建成功,小鼠一般性状无改变,小鼠大脑中动脉、冠脉、肺动脉和肾动脉组织中Cx43蛋白表达均下降.因此,可作为长期稳定模型研究血管平滑肌Cx43的功能.结论 应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统成功构建了VSMC-Cx43-/-基因敲除小鼠模型,为深入研究Cx43在血管疾病中的作用提供工具.