SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测水泡性口炎病毒方法的建立

本研究旨在建立一种快速、灵敏的用于诊断水泡性口炎的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法.通过RT-PCR分别扩增印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IN)和新泽西型水泡性口炎病毒(VSV-NJ)的G基因,然后将其连接到克隆载体pMD19-T上,构建质粒标准品pMD-VSV-IN-G和pMD-VSV-NJ-G.根据GenBank中VSV-IN和VSV-NJ的G基因保守序列设计引物,利用SYBR Green Ⅰ法进行实时荧光定量RT-PCR,建立标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验.结果,在拷贝数6.82～6.82X108copies/μL范围内,Ct值与质粒拷贝数的对数值呈良好的线性关系,pMD-VSV-IN-G标准曲线的R2值为0.998 12,pMD-VSV-NJ-G标准曲线的R2值为0.997 48;检测其他病毒均无特异性扩增曲线,特异性良好.pMD-VSV-IN-G的检测灵敏度为6.82 copies/μL,pMD-VSV-NJ-G的检测灵敏度也为6.82 copies/μL,是普通RT-PCR方法的10倍.用该方法对实验室保存的VSV-IN和VSV-NJ各5份攻毒小鼠样品进行检测,检测结果与普通RT-PCR检测一致.上述结果表明,本检测方法的建立对快速、灵敏鉴别诊断IN型和NJ型水泡性口炎病毒具有重要的应用价值.