Purificação Da Nucleosídeo Trifosfato Difosfohidrolase 1 (ntpdase 1) Antigênica De Leishmania Infantum

As NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfohidrolases) são enzimas que hidrolisam nucleosídeos di- e trifosfatados sob ativação de íons bivalentes. Uma atividade NTPDásica foi caracterizada em promastigotas de Leishmania infantum, um protozoário causador de leishmaniose visceral.Neste trabalho, a NTPDase 1 foi purificada de preparação de promastigotas usando como estratégia eletroforese em gel não-desnaturante e os detergentes deoxicolato de sódio e Triton X-100, os quais preservam a atividade fosfohidrolítica desta enzima. Após eletroforese, incubação do gel com ATP e inibidor de ATPases do tipo P permitiu a visualização de uma única banda com depósito branco de fosfato de cálcio. Esta banda ativa foi isolada e por SDS-PAGE e coloração pela prata foi identificada como polipeptídeos de 50 e 47 kDa. Por Western blot, os dois polipeptídeos foram reconhecidos pelo soro imune anti-LbB1LJ, o qual reconhece especificamente a porção N-terminal do domínio B de NTPDases 1 de Leishmania. Por espectrometria de massas, a identidade da NTPDase 1 foi confirmada pela identificação de seis peptídeos trípticos coincidentes com a NTPDase 1 anotada em seu genoma (NCBI gi|134068433), uma cobertura de 19% de sua sequência primária. As atividades ATPásica (555 ± 93 nmol Pi x mg-1 x min-1) e ADPásica (644 ± 38 nmol Pi x mg-1 x min-1) revelaram um índice de purificação de aproximadamente 62 vezes e uma razão de atividade ATPase/ADPase de aproximadamente 1, confirmando a efetividade desta estratégia para o isolamento da NTPDase 1 de promastigotas de L. infantum.