含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-1)对猪伪狂犬病毒复制的影响

猪伪狂犬病是伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种烈性接触性传染病,其感染宿主会触发机体先天免疫应答,引起I型干扰素(Type Ⅰ interferon,IFN-1)和炎性细胞因子等细胞因子的产生,为研究可诱导产生炎性细胞因子的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase 1,caspase-1)的基因敲除对PRV复制的影响,本试验利用近年来发展迅速的一项规律性短重复回文序列簇/Cas9核酸酶(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated system 9,CRISPR/Cas9)基因定点修饰技术构建猪肾上皮细胞(Porcine kidney epithelial cells,PK15)caspase-1基因稳定敲除细胞系,并通过T7核酸酶检测敲除效率;细胞毒性(Cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒检测PK15敲除caspase-1增殖影响;采用流式细胞术检测PRV-GFP感染PK15以及PK15-caspase-1-/-的增殖差异;实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)检测PRV-gB、TK及白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IFN-β、干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes 20,ISG20)mRNA的表达;Western Blot检测PRV-gB蛋白表达;滴度测定检测子代病毒滴度.结果表明,2对特异性单链引导RNA(Single guide RNA,sgRNA)均能对caspase-1进行基因编辑,但经T7核酸酶酶切进行基因编辑效率分析结果表明sgRNA2的基因编辑效率较高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明caspase-1基因敲除对PK15以及PK15-caspase-1-/细胞活力无影响(P＞0.05);流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-caspase-1-/-中的增殖显著低于PK15细胞(P＜0.05);定量RT-PCR结果表明PRV-gB、TK基因在PK15-caspase-1-/-的mRNA表达显著低于PK15细胞(gB:P＜0.05,TK:P＜0.05),而IFN-β、ISG20基因在PK15-caspase-1-/的mRNA表达显著高于PK15细胞(gB:P＜0.05,TK:P＜0.05);WesternBlot结果表明,PRV的gB蛋白在PK15-caspase-1-/-的表达显著低于PK15细胞(P＜0.05);滴度测定结果表明,敲除caspase-1能够抑制PRV子代病毒的增殖.以上结果均表明caspase-1基因敲除可抑制PRV在PK15细胞中复制.