xCas9及SpCas9-NG切刻突变体的构建及活性评价

通常使用的CRISPR/Cas9系统仅能识别靶标序列为NGG的原间隔序列临近基序(protospacer adjacent motif,PAM),而进化的xCas9、SpCas9-NG系统可识别序列为NG的PAM,扩大了 靶标的识别范围,但脱靶效应却一直阻碍CRISPR/Cas9系统的发展,而双切刻系统会增加DNA的靶向特异性.为了提高PAM为NG的CRISPR/Cas9系统基因编辑的特异性,本研究设计并构建xCas9-D10A、SpCas9-NG-D10A、xCas9-H840A、SpCas9-NG-H840A 四个切刻突变体以及相应的单链向导 RNA(single guide RNA,sgRNA)表达载体,与双荧光素酶报告基因载体SSA-DKK2、SSA-DKK1构成特定的组合,共转染绵羊(Ovis aries)成纤维细胞,通过双荧光素酶活性检测的方式来验证DNA切割效率.结果表明,SpCas9-NG-Dl0A、SpCas9-NG-H840A突变体针对多数靶标载体其报告基因活性显著大于对照组(P＜0.05),xCas9-H840A突变体完全没有活性,而xCas9-D10A仅在DKK1基因中表现出切割活性.相对而言,SpCas9-NG-D10A突变体活性稳定,切割DNA单链效率较高,故此载体可用于进一步的研究应用.本研究结果对于PAM为NG的CRISPR/Cas9双切刻系统的进一步研究及应用提供了重要的参考数据.