结核分枝杆菌双靶标环介导恒温扩增检测方法的建立与应用

目的 建立基于双靶标环介导恒温扩增(LAMP)的结核分枝杆菌(MTB)检测技术并应用于临床.方法 以结核分枝杆菌复合群(MTBC)插入序列IS6110和MTB mtp40基因为检测靶标,分别设计1套LAMP引物.通过引物浓度和反应条件优化,建立基于双靶标的检测方法(mtp40-LAMP和IS6110-LAMP),比较2种方法的灵敏度和特异性.应用建立的mtp40-LAMP和IS6110-LAMP方法与PCR、萋-尼氏抗酸染色法和分枝杆菌分离培养法,分别对55例患者的痰标本进行检测与鉴定,通过对其结果的比较分析评价mtp40-LAMP和IS6110-LAMP方法的实用性.结果 灵敏度试验显示,mtp40-LAMP和IS6110-LAMP方法可检出MTB基因组DNA最低浓度为125 fg/μl,比常规的PCR方法高10～100倍.mtp40-LAMP和IS6110-LAMP方法的特异性为100％,能检测MTB菌株并能从MTBC中鉴别MTB.痰标本检测显示,IS6110-LAMP与PNB鉴定结果…致性检验的Kappa值为0.881(P＜0.01),mtp40-LAMP与TCH鉴定结果的Kappa值为0.887(P＜0.01).与PCR方法和萋-尼氏抗酸染色法检测结果比较,mtp40-LAMP和IS6110-LAMP方法敏感性更高.反应体系中加入MG指示剂可直接通过肉眼观察颜色变化进行结果判定,实现了快速闭管检测.从样本处理(35 min)、扩增反应(40 min)到结果验证(1～2 min),整个检测过程80 min内即可完成.结论 基于LAMP技术建立的mtp40-LAMP和IS6110-LAMP双靶标检测方法敏感性高、特异性强,能够快速、准确地检测和鉴别MTB,可作为潜在的MTB快速筛查或诊断工具.