大鼠S100A8基因启动子质粒的构建及其SOX7结合元件的初步鉴定

目的:构建大鼠S100钙结合蛋白A8(S100A8)基因启动子荧光素酶报告质粒,并在HEK-293T中检查过表达性别决定区Y框蛋白7(SOX7)基因对S100A8启动子活性的影响,同时筛选可能的SOX7结合元件.方法:采用PCR技术扩增大鼠S100A8启动子全长,经双酶切后连接到pGL3-basic中,命名为pGL3-S100A8-FL.将pGL3-S100A8-FL与前期构建的pIRES2-SOX7质粒共转染HEK-293T,再测定荧光素酶活性.此外,运用JASPAR预测S100A8启动子区可能包含的SOX7结合元件,并依此构建4个启动子截短质粒(即pGL3-S100A8-1～4).将pGL3-S100A8-FL和pGL3-S 100A8-1～4分别与pIRES2-SOX7共转染HEK-293T,检查荧光素酶活性.接着构建SOX7结合元件突变的S100A8启动子质粒(即pGL3-S100A8-M),与pIRES2-SOX7转染HEK-293T,检测其荧光素酶活性.结果:将pGL3-S100A8-FL与pIRES2-SOX7共转染HEK-293T,发现过表达SOX7可显著增加pGL3-S100A8-FL启动子活性.将pGL3-S100A8-FL和pGL3-S100A8-1～4分别与pIRES2-SOX7共转染HEK-293T,发现pGL3-S100A8-4启动子活性显著低于pGL3-S100A8-FL和pGL3-S100A8-1～3,提示SOX7与S100A8启动子结合元件可能位于-200～+51 nt区域内.将-86～-57 nt元件突变质粒(pGL3-S100A8-M)或pGL3-S100A8-FL与pIRES2-SOX7共转HEK-293T,发现pGL3-S100A8-M启动子活性显著低于pGL3-S100A8-FL.提示SOX7可能与S100A8启动子-86～-57 nt元件结合.结论:成功构建大鼠S100A8基因启动子全长、截短和突变荧光素酶报告质粒,并初步确定S100A8启动子区的SOX7结合元件.