利用CRISPR/Cas9编辑系统构建pAPN基因敲除的IPI-2I细胞系

试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得猪氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)基因敲除的猪回肠上皮(immortal pig intestinal-2I,IPI-2I)细胞系,进而在细胞水平上研究pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用及相互作用机制.本研究将已构建好的靶向pA PN基因第2外显子上的2个sgRNA载体(pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5)共转染IPI-2I细胞.转染48 h后,荧光显微镜下观察IPI-2I细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的发光情况,并用流式细胞仪收集带有GFP和RFP荧光标记的细胞,用来筛选单克隆细胞.然后取少量单克隆细胞提取DNA,用PCR扩增打靶区域附近的序列,测序鉴定其基因型,以获得pA PN基因敲除的IPI-2I细胞株.选择野生型和pA PN基因纯合片段敲除的IPI-2I细胞,提取细胞总蛋白,通过Western blotting检测pA PN基因敲除前后IPI-2I细胞中pAPN蛋白的表达.结果表明,转染48 h后,通过荧光显微镜可以观察到IPI-2I细胞中大部分细胞能够同时表达GFP和RFP,说明pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5质粒载体已经转入IPI-2I细胞.PCR和测序结果表明,共获得48株片段敲除单克隆细胞(片段敲除效率为15.5％),其中16株为单等位基因敲除,32株为双等位基因敲除;在32株双等位基因敲除细胞中,有23株细胞为纯合片段敲除.Western blotting结果表明,pA PN基因纯合片段敲除的细胞中检测不到pAPN蛋白的表达.综上,本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了pA PN基因纯合敲除的IPI-2I细胞系,为阐明pA PN在冠状病毒入侵过程中的作用机制以及制备猪抗病新品种奠定了基础.