人源β-N-乙酰葡糖胺转移酶Ⅰ(hGnT-Ⅰ)的原核表达与活性鉴定

β-N-乙酰葡糖胺转移酶Ⅰ(hGnT-Ⅰ)功能为在高尔基体中向糖蛋白上的N-寡糖M5GN2结构添加一个β-1,2连接的N-乙酰葡糖胺.为大量获得具有活性的hGnT-Ⅰ蛋白,构建了重组表达质粒pET28a-MGAT1ΔTM并将其在大肠杆菌Rosetta菌株中表达.对诱导条件进行优化后,将获得的可溶性重组蛋白His-hGnT-IATM进行镍柱亲和纯化并通过高效液相色谱(HPLC)检测其体外活性和底物特异性.结果 表明,大肠杆菌ROSETTA体系可以成功表达可溶性重组hGnT-Ⅰ蛋白;该蛋白质相对分子质量约为42800,在体外反应中具有相应的糖基转移酶活性;除天然糖链底物M5GN2外,该蛋白质可以识别非天然糖链底物M3GN2;产物经酶切反应验证,证明该蛋白质催化添加一个β糖苷键连接的N-乙酰葡糖胺的反应.本研究所开发的原核表达体系可以大量制备纯化的功能性重组hGnT-Ⅰ蛋白,以应用于该蛋白质的性质研究以及N-糖链的体外合成.