NLRP3基因过表达载体的建立及鉴定

本研究旨在构建携带小鼠nlrp3蛋白的过表达真核载体.首先从高脂饮食喂养3个月的C57BL/6J小鼠上剪取肝脏组织,液氮冻存.快速剪取适量肝脏组织,冰上研磨,Trizol法提取总RNA,逆转录获得cDNA,然后PCR扩增nlrp3基因的编码区.PCR产物电泳回收,经过N0tⅠ及Nhe Ⅰ双酶切后,将其克隆到真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro中.重组质粒电转进入感受态DH5α,过夜培养后挑取单个菌落过夜扩大培养.然后提取质粒,酶切鉴定后测序.将克隆成功的重组质粒转染HEK293T细胞,培养3d后收集细胞蛋白,用Western blotting检测nlrp3的表达水平,研究显示,重组质粒pCDH-NLRP3较空白质粒pCDH-NULL的nlrp3蛋白表达水平明显增加(p＜0.01).本研究成功构建了nlrp3过表达载体,为进一步研究其作用机制提供了基础工具.