人粪便宏基因组α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质及其对芦丁的生物转化

HFM-rha78是本实验室从健康人体粪便宏基因组DNA中获得的新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因.该基因全长2 166 bp,编码蛋白质分子质量为83 kD,等电点5.58,其二级结构以α螺旋和无规卷曲为主,整体表现出亲水性,其氨基酸序列与GenBank收录的序列一致性仅为48％.系统进化树表明,该酶被分类至亚家族Ⅱ,其催化广义酸和广义碱均为谷氨酸,催化残基高度保守.为明确其酶学性质,以对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷(p-nitrophenyl-αr-L-rhamnopyranoside,pNPR)为底物,通过紫外-可见分光光度法测定产物对硝基苯酚的生成量,得到HFM-Rha78的最适反应温度为50℃,最适pH为6.5,且在30 ～ 46℃下保温30 min,不影响活力.为初步研究其对芦丁的水解能力,首先对HFM-Rha78的有机溶剂耐受性进行了研究.结果表明,该酶能普遍耐受1％的有机溶剂,甚至1％ ～ 5％的异丙醇和1％的β-巯基乙醇,有提高其活性的能力.当DMSO浓度为10％时,仍能保持79％的酶活性.HFM-Rha78对底物pNPR的Vmax为129.9 μmol min-1 mg-1,HFM-Rha78的KM较大,为26.0 mmol L-1.转换数kcat为185.1 s-1,催化效率kcat/KM为7.1×103s-1 mol-1L.采用高效液相色谱仪检测HFM-Rha78水解芦丁的能力.结果表明,37℃条件下,随着酶浓度和水解时间增加,芦丁转化率增大.反应10h时,芦丁转化率达41.8％.本研究获得了HFM-Rha78的最适反应条件,并确定其可特异性生物转化芦丁为异槲皮素.