PE、EV71及CoxA16基因探针的制备

目的 制备地高辛标记基因探针,利用分子杂交试验同时检测手足口病患者粪便标本中的肠道病毒(Pan-enterovirus,PE)、肠道病毒71型(Enterovirs 71 EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsachie virus,CoxA16). 方法 根据GenBank已发表的基因序列,分别在PE、EV71、CoxA16保守区设计3对特异性寡核苷酸引物,进行实时荧光定量PCR检测.从PE、EV71、Co xA 16阳性标本中分离病毒,提取RNA,以RT-PCR扩增产物作为基因探针的目的基因,采用随机引物法进行Digxigenin-11-dUTP标记,采用分子杂交试验检测3种基因探针的灵敏性和特异性. 结果 RT-PCR分别扩增出116、226、208 bp目的基因片段,经标记后作为检测PE、EV71、CoxA16的3种高纯度的基因探针,对相应病毒RNA的最低检出限均为1 pg,可分别与PE(+)、EV71(+)、CoxA16(+)标本提取的RNA发生特异性杂交,与乙型脑炎病毒、诺如病毒、轮状病毒、H3N2、甲型H1N1流感病毒的核酸无杂交反应. 结论 制备的PE、EV71及CoxA16基因探针灵敏、特异,操作简单,适用于手足口病病原的实验室检测.