去甲斑蝥素体外对骨巨细胞瘤细胞的活性、侵袭能力及凋亡的作用及其机制初探

目的:探讨去甲斑蝥素(NCTD)体外对骨巨细胞瘤(GCTB)细胞活性、侵袭能力及凋亡的作用及其相关机制。方法:收集复旦大学附属华山医院2018年1月—2019年3月骨科3例GCTB患者的术中肿瘤组织标本，其中男2例、女1例，年龄分别为35岁、40岁、27岁，Campanacci影像学分级均为2级。(1)将GCTB标本组织进行原代细胞分离、培养、鉴定。(2)将制备好的GCTB细胞分为对照组及4个浓度NCTD组，其中NCTD组分别加入5、10、20、40 μg/mL的NCTD溶液200 μL；对照组加入α-MEM细胞培养基200 μL。培养后在显微镜下观察各组的细胞形态，采用CCK-8法检测各组细胞的活性。(3)将制备好的GCTB细胞分为对照组、5 μg/mL NCTD组、20 μg/mL NCTD组，采用Transwell实验检测各组细胞的侵袭能力，采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率，采用caspase-3、caspase-9酶活性检测试剂盒检测各组细胞中caspase-3和caspase-9的酶活性，采用DHE染色检测GCTB细胞中活性氧(ROS)水平，采用JC-1染色检测GCTB细胞线粒体膜电位水平，采用Western blot检测相关凋亡蛋白cleaved caspase-3、caspase-3、cleaved caspase-9、caspase-9、B细胞淋巴瘤相关蛋白X(Bax)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)的表达情况。结果:(1)GCTB组织标本经体外分离培养、传代后，镜下多为不规则形的间质细胞，细胞核周围CD68表达阳性，提示所提取分离细胞为GCTB细胞。(2)GCTB细胞活性检测，显微镜下观察显示，NCTD对GCTB细胞的增殖有抑制作用，随NCTD浓度的增加，细胞逐渐出现皱缩、悬浮，逐渐丧失原有形态；CCK-8检测结果显示，对照组、5 μg/mL NCTD组、10 μg/mL NCTD组、20 μg/mL NCTD组、40 μg/mLNCTD组GCTB细胞的存活率分别为100%、76.45%±9.86%、62.34%±10.21%、39.74%±8.36%、25.54%±7.18%，随着NCTD浓度的增加，细胞存活率逐渐降低，各组间比较差异有统计学意义( F＝75.716, P<0.01)。(3)Transwell小室细胞侵袭能力检测，对照组、5 μg/mL NCTD组、20 μg/mL NCTD组侵袭细胞比例分别为49.33%±9.84%、32.84%±2.73%、8.34%±1.41%，各组间比较差异有统计学意义( F＝36.034, P<0.01)。细胞凋亡检测，对照组、5 μg/mL NCTD组、20 μg/mL NCTD组细胞凋亡率分别为4.73%±0.05%、14.23%±0.85%、51.21%±10.47%，各组间比较差异有统计学意义( F＝49.183, P<0.01)。caspase-3、caspase-9酶活性的检测，对照组、5 μg/mL NCTD组、20 μg/mL NCTD组caspase-3、caspase-9酶活性逐渐增高，各组间比较差异均有统计学意义( F＝15.223、30.841, P值均<0.01)。GCTB细胞ROS水平检测，随着NCTD浓度的增加，对照组、5 μg/mL NCTD组、20 μg/mL NCTD组GCTB细胞中ROS的水平明显升高，并呈剂量依赖性。GCTB细胞线粒体膜电位水平检测，对照组、5 μg/mL NCTD组、20 μg/mL NCTD组GCTB细胞胞膜电位的红/绿光强度比分别为2.01±0.11、1.27±0.07、0.79±0.14，各组间比较差异有统计学意义( F＝128.641, P<0.01)。凋亡相关蛋白检测，对照组、5μg/mL NCTD组、20μg/mL NCTD组cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白的相对表达量逐渐升高，Bcl-2蛋白的相对表达量则逐渐降低，各组间比较差异均有统计学意义( P值均<0.01)；而caspase-3、caspase-9蛋白的表达水平无明显变化，各组间比较差异均无统计学意义( P值均>0.05)。 结论:NCTD可显著抑制GCTB细胞的体外活性，增加细胞侵袭能力，促进细胞凋亡。其作用机制可能与降低细胞线粒体膜电位、提高细胞活性氧水平、调整凋亡相关蛋白的表达有关。