重组人源甲胎蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化
Laboratory Medicine and Clinic(2014)
Abstract
目的:从毕赤酵母GS115蛋白表达体系入手,实现人源甲胎蛋白(AFP)的重组克隆、异源高效表达、蛋白纯化并得到具有临床免疫原性的高纯度AFP。方法通过聚合酶链反应(PCR)从重组质粒pReceiver‐AFP扩增到目的基因片段,构建酵母重组表达质pPICZαA‐AFP,经测序比对与GenBank公开的AFP序列一致。将重组质粒pPICZαA‐AFP转入毕赤酵母GS115,通过甲醇诱导表达目的蛋白AFP。收集蛋白后用硫酸铵分级沉淀法对AFP进行纯化,高效液相色谱法(HPLC)检测纯度,在临床医院通过电化学发光法对其蛋白含量定值。结果研究发现AFP在酵母GS115中经甲醇诱导表达主要分泌到胞外培养基上清,免疫印迹试验能够检测到AFP蛋白条带,经硫酸铵分级沉淀,87%AFP目的蛋白存在于55%硫酸铵沉淀集份,HPLC检测其纯度为98.844%,电化学发光法检测其水平为3473ng/mL。最后与临床肝癌患者血清标本比对,蛋白的相对分子质量大小一致,表明其糖基化水平与临床标本相当。结论通过毕赤酵母甲醇诱导表达系统可以制备高纯度的、具有生物活性的、可用于肿瘤临床检测的AFP标准物质及其可以溯源的校准品、质控品和相关诊断试剂。
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Key words
alpha-fetoprotein,Pichia,expression,purification
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