重组人源甲胎蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化

目的：从毕赤酵母GS115蛋白表达体系入手，实现人源甲胎蛋白（AFP）的重组克隆、异源高效表达、蛋白纯化并得到具有临床免疫原性的高纯度AFP。方法通过聚合酶链反应（PCR）从重组质粒pReceiver‐AFP扩增到目的基因片段，构建酵母重组表达质pPICZαA‐AFP，经测序比对与GenBank公开的AFP序列一致。将重组质粒pPICZαA‐AFP转入毕赤酵母GS115，通过甲醇诱导表达目的蛋白AFP。收集蛋白后用硫酸铵分级沉淀法对AFP进行纯化，高效液相色谱法（HPLC）检测纯度，在临床医院通过电化学发光法对其蛋白含量定值。结果研究发现AFP在酵母GS115中经甲醇诱导表达主要分泌到胞外培养基上清，免疫印迹试验能够检测到AFP蛋白条带，经硫酸铵分级沉淀，87％AFP目的蛋白存在于55％硫酸铵沉淀集份，HPLC检测其纯度为98．844％，电化学发光法检测其水平为3473ng／mL。最后与临床肝癌患者血清标本比对，蛋白的相对分子质量大小一致，表明其糖基化水平与临床标本相当。结论通过毕赤酵母甲醇诱导表达系统可以制备高纯度的、具有生物活性的、可用于肿瘤临床检测的AFP标准物质及其可以溯源的校准品、质控品和相关诊断试剂。