基于CRISPRR/Cas9技术的弓形虫rop16Ⅰ/Ⅲ缺陷虫株的构建及毒力鉴定

目的 构建并鉴定弓形虫RH株rop16Ⅰ/Ⅲ缺陷虫株.方法 利用CRISPR-Cas9技术进行构建基因缺陷虫株.运用E-CRISPR数据库设计gRNA,并使用定点突变试剂盒突变pSAG1∷Cas9-U6∷sgUPRT质粒上的gRNA,构建pSAG1∷Cas9-U6∷sgrop16质粒.此外将rop16上游序列、乙胺嘧啶抗性基因、rop16下游序列3个片段连接成donorDNA,克隆于pUC19质粒上,PCR扩增donor DNA片段.pSAG1∷Cas9-U6∷sgrop16质粒和donor DNA片段电穿孔转染弓形虫,电转后悬液接种于HFF-1细胞中,3μmol/L乙胺嘧啶筛选电转后的虫株.PCR和Western blotting鉴定克隆化筛选虫株.吉姆萨染色分别比较RH株和RH△rop16株对HFF-1细胞的增殖与入侵.并比较RH株和RH△roop16株分别感染昆明小鼠后小鼠的生存和死亡率.结果 经测序比对,成功构建了pSAG1∷Cas9-U6∷sgrop16质粒和pUC19-donorDNA质粒.PCR鉴定结果显示,DHFR编码(编码乙胺嘧啶抗性基因)序列成功插入至靶点位置,Western blotting分析结果未见RH△rop16株有Rop16Ⅰ/Ⅲ蛋白表达.吉姆萨染色后计数结果表明,RH株感染的细胞内每个纳虫泡内速殖子的平均数显著高于RH△rop16虫株.毒力试验结果显示,RH株感染的小鼠在第7d即出现死亡,而rop16Ⅰ/Ⅲ缺陷株在第9d出现死亡,但两种弓形虫株感染动物在第10 d均全部死亡,两组间无统计学差异.结论 利用CRISPR-Cas9技术成功构建了rop16Ⅰ/Ⅲ缺陷的弓形虫RH虫株,rop16Ⅰ/Ⅲ基因敲除对弓形虫RH株毒力无明显影响.