下调SIRT6对肝癌干细胞干性维持的抑制作用

[目的]探讨抑制SIRT6表达在肝癌干细胞干性维持中的作用及潜在机制.[方法]在不同肝癌细胞系中构建肝癌干细胞模型(Lv-Pnanog-GFP),利用流式细胞术分选出不同来源的肝癌干细胞,采用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)和免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)技术检测SIRT6蛋白在肝癌干细胞中的表达水平;构建SIRT6慢病毒短发卡RNA感染载体(shSIRT6)感染肝癌干细胞,采用WB技术检测shSIRT6的干扰效率;采用实时定量反转录聚合酶链反应(real-time PCR)检测抑制SIRT6后肝癌干细胞的干性基因(Nanog、OCT4、CD13、SOX2、EpCAM、CD44) mRNA的表达水平,ICC方法检测EpCAM蛋白的表达水平;采用5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)试剂盒和细胞增殖活力(CCK8)试剂盒检测抑制SIRT6表达后肝癌干细胞的增殖能力;采用克隆形成和成球实验检测抑制SIRT6后肝癌干细胞的自我更新能力;利用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)试剂盒检测抑制SIRT6后肝癌干细胞的衰老水平.[结果] WB和ICC检测结果显示,Nanog阳性肝癌干细胞中SIRT6表达水平明显高于Nanog阴性肝癌细胞;real-time PCR检测结果显示,抑制SIRT6后,肝癌干细胞的干性基因(Nanog、OCT4、CD13、SOX2、EpCAM、CD44)mRNA表达水平降低.与real-time PCR结果一致,ICC结果也表明,抑制SIRT6后,干性标志物EpCAM的蛋白表达水平降低(P＜0.01).细胞增殖检测结果进一步显示,抑制SIRT6,肝癌干细胞的增殖水平降低(P＜0.05).克隆形成实验和细胞成球实验结果显示,抑制SIRT6导致肝癌干细胞的克隆形成能力和成球能力一致性降低(P＜0.01).SA-β-Gal活性检测结果显示,抑制SIRT6后,肝癌干细胞的SA-β-Gal活性显著性提高(P＜0.01).[结论]肝癌干细胞高表达SIRT6,通过抑制SIRT6表达可诱导肝癌干细胞发生衰老,导致其干性标志物表达水平下降,增殖能力降低,肝癌干细胞克隆形成和成球能力下降.