人视网膜胶质细胞的原代培养与鉴定方法

背景 人视网膜胶质细胞在视网膜增生性疾病的研究中有重要作用,以往研究者已成功地培养了人视网膜胶质细胞,但方法学有待进一步改进以达到细胞收获量更大的目的. 目的 建立快速、收获量大且纯度高的视网膜胶质细胞的培养方法,对目标细胞的抗原表达特点进行分析. 方法 取正常人角膜移植供体眼球分离视网膜组织,采用质量分数2％胰蛋白酶和质量分数0.133％胶原酶Ⅵ用二步法消化获取人视网膜胶质细胞,用含质量分数10％胎牛血清的人内皮细胞培养液,其中添加内皮细胞生长因子(β-ECGF)和肝素钠,对分离的细胞进行体外培养,培养皿用纤维黏连蛋白(FN)包被以促进人视网膜胶质细胞贴壁.观察收获的目标细胞的形态特征,采用活体显微镜下形态学观察、常规组织学观察法观察目标细胞的生长,同时采用免疫组织化学法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、波形蛋白(Vimentin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、S-100、CD34、Ⅷ因子在细胞中的表达以鉴定目标细胞. 结果 应用胰蛋白酶、胶原酶二步消化法可成功获取人视网膜胶质细胞,原代培养的细胞72 h贴壁,第9～10天细胞达到融合状态呈花瓣状；常规组织学观察显示细胞核呈鲜亮蓝色,细胞质(盘膜)呈淡红色,培养细胞GFAP、Vimentin呈强阳性表达,NSE、S100、CD34、Ⅷ因子相关抗原表达呈阴性反应. 结论 应用胰蛋白酶、胶原蛋白酶消化法以及利用10％胎牛血清的人内皮细胞培养基,添加生长因子和肝素钠,并用FN包被培养皿进行体外培养可达到快速、大量分离和纯化人视网膜胶质细胞的目的,鉴定结果提示培养的目标细胞为人视网膜胶质细胞,其形态与以往报道的有所不同,具体特点尚需进一步研究.