靶向OPN基因shRNA慢病毒载体的构建及其对人肺腺癌细胞A549侵袭能力的影响

目的:通过构建慢病毒介导的骨桥蛋白(OPN)基因沉默shRNA载体,并转染人肺腺癌细胞A549建立OPN基因稳定沉默的肺癌细胞株,为进一步研究OPN与非小细胞肺癌侵袭转移相关分子机制奠定细胞学基础.方法:设计靶向OPN基因的3条siRNA靶点系列,分别合成含有干扰系列的shRNA,与双酶切后的pLVX-shRNA2-puro载体连接,构建pLVX-shRNA2-puro-OPN1、pLVX-shRNA2-puro-OPN2和pLVX-shRNA2-puro-OPN3病毒载体,并转化于DH5α感受态细胞,挑阳性克隆质粒测序,通过转染293T细胞,获取慢病毒颗粒,转染人肺腺癌细胞A549,用含嘌呤霉素培养基筛选培养,应用定量PCR及Western Blot检测OPN基因沉默效果,选用沉默效果最佳的pLVX-shRNA2-puro-OPN1建立OPN基因稳定沉默细胞株,并用transwell方法检测各组肺癌细胞株的侵袭能力.结果:经测序鉴定成功构建pLVX-shRNA2-puro-OPN慢病毒载体,定量PCR及Western Blot检测发现转染pLVX-shRNA2-puro-OPN-1、pLVX-shRNA2-puro-OPN2慢病毒载体可明显降低A549细胞株中的OPNmRNA及蛋白水平;OPN基因稳定沉默明显抑制A549细胞株的侵袭能力.结论:成功构建pLVX-shRNA2-puro-OPN慢病毒载体,OPN基因稳定沉默明显抑制A549细胞株的侵袭能力.