FGF-2真核表达质粒的构建及对C3H10细胞增殖及成软骨分化的影响

目的:构建成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)真核表达质粒,检测其对小鼠间充质干细胞C3H10增殖、成骨及成软骨分化作用的影响.方法:以质粒pAd-Trace-FGF-2为模板,PCR扩增目的基因FGF-2,经BglⅡ、SalⅠ双酶切后连接至pIRES2-EGFP表达载体中获得pIRES2-EGFP-FGF-2真核表达质粒,脂质体转染到C3H10细胞中,另设pIRES2-EGFP空载体转染对照组和空白细胞对照组.RT-PCR及Western blot法验证各组FGF-2的表达水平,MTT法和流式细胞术检测细胞的增殖活力及细胞周期分布,RT-PCR检测成骨及成软骨、Wnt信号通路相关基因的mRNA水平表达变化,Western blot法检测Ⅱ型胶原(collagenⅡ,ColⅡ)的表达,甲苯胺蓝染色检测软骨基质的表达.结果:重组表达质粒pIRES2-EGFP-FGF-2经双酶切及测序证实构建正确;质粒转染C3H10细胞后,其FGF-2基因的mRNA和蛋白水平表达较2个对照组明显增高,细胞增殖活力明显增高(P＜0.05),软骨相关标志物Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)、ColⅡ、蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)mRNA转录水平较2个对照组均明显增高(P＜0.05),骨钙蛋白(osteocalcin,OC)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)mRNA转录水平无明显升高(P＞0.05),Wnt5a及Fzd8 mRNA转录水平降低(P＜0.05),FGF-2转染组细胞甲苯胺蓝染色呈现紫红色异染.结论:成功构建FGF-2基因重组真核表达质粒,FGF-2过表达可提高C3H10细胞的增殖活力,对C3H10细胞有成软骨效应,但短期成骨效应不明显,可能与下调Wnt5a及受体Fzd8的表达有关.