含人干细胞白血病基因慢病毒载体转染Cajal 样间质细胞的效果研究

目的：观察携带增强绿色荧光蛋白（GFP）的含人干细胞白血病（SCL）基因慢病毒载体转染体外培养的豚鼠膀胱 Cajal 样间质细胞（ICC）的效果。方法2014年10月—2015年8月，选取普通级成年健康豚鼠16只。构建含人 SCL 基因的慢病毒载体，并标定病毒滴度；采用随机数字表法选取健康豚鼠4只，采用颈椎脱臼方法将其杀死，体外培养豚鼠膀胱 ICC。设置不同感染复数（MOI）（0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0），利用含人 SCL 基因的慢病毒载体转染 ICC，在激光共聚焦显微镜下观察 ICC 生长状态并计算转染效率，确定最佳 MOI。采用随机数字表法将 ICC 分为正常对照组、空白质粒对照组与慢病毒转染组，其中正常对照组加入1％磷酸盐缓冲液（PBS），空白质粒对照组加入空慢病毒，慢病毒转染组按最佳 MOI 加入含人 SCL 基因的慢病毒载体，计算各组转染效率，确定最佳转染时间。采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测 SCL mRNA 表达情况。上述实验均独立重复4次。结果经测定，病毒滴度为5×108 TU/ ml。倒置显微镜下发现一些特征性梭形细胞，其两侧有显著外凸分枝，细胞核较大，其外形规则，有序地实现细胞贴壁，而其他未贴壁细胞则呈现与 ICC 不一样的形态，胞体多为椭圆形，细胞两极无突起，整体形状扁平。激光共聚焦显微镜下可以发现酪氨酸蛋白激酶生长因子受体（c-kit）受体成功表达，证实培养的细胞是膀胱 ICC。观察各组 ICC 生长状态，当 MOI 为0.5、1.0、5.0、10.0时，细胞生长状态较好，无细胞死亡，当 MOI为50.0、100.0时，可见部分细胞死亡，细胞活性降低；MOI 为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于 MOI为0.5时（P ＜0.05）；MOI 为5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于 MOI 为1.0时（P ＜0.05）；MOI 为10.0、50.0、100.0时的转染效率高于 MOI 为5.0时（P ＜0.05）；MOI 为50.0、100.0时的转染效率高于 MOI 为10.0时（P＜0.05）；综合 ICC 生长状态及转染效率，确定含人 SCL 基因慢病毒载体转染 ICC 的最佳 MOI 为10.0。正常对照组、空白质粒对照组 ICC 中无 GFP 表达；慢病毒转染组转染3 d 时 ICC 中 GFP 表达强度高于转染2 d、转染5 d 时，确定含人 SCL 基因慢病毒载体转染 ICC 的最佳转染时间为3 d。慢病毒转染组中扩增产物大小与目的片段大小1036 bp 一致，而正常对照组及空白质粒对照组均未见特异性条带表达，表明 SCL 基因成功导入 ICC。结论利用含人 SCL 基因慢病毒载体能高效转染体外培养的 ICC，并成功介导 SCL 基因在 ICC 中的表达，为下一步研究利用 SCL 基因进行体内转染实验奠定基础。