表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

[背景]H9亚型禽流感病毒(AIV)存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁.水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用.因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义.鸭肠炎病毒(DEV)属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率.DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力.[目的]构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性.[方法]以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性.以103 TCID50免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量(103-106TCID50)rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制(HI)抗体,并在免疫后28 d,以108EID50的剂量静脉注射H9N2 AIV(A/duck/GD/08),攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验.[结果]将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA.PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白.重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代.重组病毒rDEV-ΔgE-HA以103 TCID50免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击.重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,103TCID50剂量免疫组HI抗体效价达到1:24,而104-106TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:22.4-1:23.免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,103、104、106TCID50免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而105TCID50免疫组保护率为80％(4/5),1/5病毒分离阳性.[结论]成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80％免疫鸭能阻止排毒.该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础.