靶向人MGMT的shRNA干扰载体的构建与鉴定

目的:有效构建针对人MGMT(hMGMT)基因的short hairpin RNA(shRNA)质粒表达载体,转染肝癌SMMC-7721细胞,验证shRNA对肝癌SMMC-7721细胞MGMT基因的干扰效果,进一步研究hMGMT的功能及临床意义.方法:设计针对hMGMT mRNA靶序列的shRNA,PCR扩增获得目的产物,通过TA克隆目的产物与酶切后的载体片段进行连接,连接后的重组载体转化到大肠杆菌,提取质粒后送测序鉴定.脂质体包裹鉴定后的重组载体,转染肝癌SMMC-7721细胞,利用Real-Time PCR及Western Blot检测RNA干扰效果.结果:重组克隆经菌落PCR及测序证实插入的序列正确,RNA干扰载体转染肝癌SMMC-7721细胞后细胞内MGMT的mRNA及蛋白水平均显著降低.结论:所制备的hMGMT-shRNA在肝癌SMMC-7721细胞中可获得高效转染,并能产生特异性的基因沉默效应,针对hMGMT为靶标的shRNA载体能够有效下调肝癌细胞中MGMT基因的表达,为研究MGMT蛋白的功能以及临床肿瘤合理用药提供思路.