神经前体细胞表达发育调控样基因4在乙型肝炎病毒复制中的作用
Chinese Journal of Infectious Diseases(2020)
摘要
目的:研究神经前体细胞表达发育调控样基因4(neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated gene 4-like,
NEDD4
L)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的影响及其可能的分子机制。
方法:采用Lipofectamine2000分别将靶向
NEDD4
L的小干扰RNA、
NEDD4
L的过表达质粒(pcDNA3.1-
NEDD4
L-HA)、HBV复制质粒(pGEM-HBV1.3)和poly(dAT:dAT)瞬时转染至HepG2细胞,并以可稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞为对照。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测
NEDD4
L、α干扰素、β干扰素、干扰素刺激基因56(interferon-stimulated gene 56,
ISG56)、黏液病毒抗性蛋白A(myxovirus resistance protein A,
MxA)、寡腺苷酸合成酶(oligoadenylate synthetase,
OAS)等的mRNA水平,以及HBV DNA和3.5 kb HBV RNA的表达水平;采用蛋白质印迹法验证NEDD4L沉默或过表达效果,并检测相关信号分子的蛋白质水平;采用酶联免疫吸附测定法检测细胞上清液中β干扰素产量。统计学方法采用
t检验。
结果:HepG2.2.15细胞中的NEDD4L mRNA和蛋白质水平分别为10.53±0.47和4.17±0.43,分别高于HepG2细胞中的1.00±0.05和1.26±0.25,差异均有统计学意义(
t=3.27,
P=0.008;
t=1.68,
P=0.030)。在敲减
NEDD4
L基因表达的细胞中,上清液HBV DNA表达水平为0.32±0.09,低于对照组的1.00±0.05,差异有统计学意义(
t=-0.93,
P=0.020);3.5 kb HBV RNA表达水平为0.49±0.11,低于对照组的1.00±0.05,差异有统计学意义(
t=-0.68,
P=0.040)。与对照组相比,
NEDD4
L敲减组的β干扰素、
ISG56、
MxA和
OAS的mRNA相对表达水平均上升,差异均有统计学意义(
t=4.66、9.38、7.29、7.01,均
P<0.01)。
NEDD4
L敲减组β干扰素含量在poly(dAT:dAT)处理和水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)刺激时分别为(776.41±115.49) ng/L和(961.21±130.19) ng/L,分别高于对照组的(320.15±56.05) ng/L和(440.17±67.82) ng/L,差异均有统计学意义(
t=2.43,
P=0.020;
t=2.85,
P=0.030);
NEDD4
L过表达组β干扰素含量在poly(dAT:dAT)处理和VSV刺激时分别为(156.18±26.47) ng/L和(176.67±34.51) ng/L,分别低于对照组的(320.38±49.39) ng/L和(440.59±68.83) ng/L,差异均有统计学意义(
t=-2.03,
P=0.040;
t=-1.93,
P=0.030)。HBV复制下调了β干扰素上游黑色素瘤分化相关蛋白5(melanoma differentiation-associated protein 5,MDA5)的蛋白质水平,而该下调作用在敲减
NEDD4
L的细胞中并不明显。
结论:HBV复制能通过促进细胞NEDD4L的表达,下调MDA5而抑制β干扰素的产生,进而辅助HBV的固有免疫逃逸。
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关键词
Hepatitis B virus,Neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated gene 4-like,Interferons
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