人鼻咽癌干细胞微球体培养并鉴定其生物特性

目的：目前分离和鉴定鼻咽癌干细胞的方法仍不成熟。探索鼻咽癌细胞系干细胞微球体培养方法，并对CNE-2细胞微球体是否具有肿瘤干细胞生物特性（干性）进行鉴定。方法人鼻咽癌细胞CNE2、C666-1细胞在含生长因子的无血清培养基（ serum-free medium， SFM）中悬浮培养。流式细胞术、Transwell小室实验、裸鼠成瘤实验、分别检测CNE2贴壁细胞（ CNE2 monolayer， CNE2-MN）及CNE2微球体细胞（ CNE2 sphere cells， CNE2-SC） CD133＋标记细胞比例，体外侵袭能力、体内成瘤能力；CNE2-SC在含血清培养基中贴壁培养观察其分化能力；实时荧光定量PCR分析CNE2-MN及CNE2-SC相关干性基因Bmi-1、Oct4、Twist1RNA的表达。结果2种细胞系均能在特殊配制的SFM中形成可以稳定传代的微球体， SFM新鲜配制、用细胞分离剂Accutase替代胰酶传代以及保持细胞的悬浮状态均有利于微球体的形成和增殖；在含血清培养基中培养能贴壁分化成CNE2-MN而无明显差异；CNE2-SC中CD133＋细胞比例（98．79％）显著高于CNE2-MN（0．98％），差异有统计学意义（ P＜0．01）；与CNE2-MN相比，CNE2-SC高表达干细胞相关基因Bmi-1、Oct4、Twist1及EMT标志物N-cadherin、Vimentin。 Transwell小室实验示CNE2-SC与CNE2-MN的穿膜细胞数分别为（122±6）个／视野及（36±7）个／视野（P＜0．05）；裸鼠成瘤实验示1×104个CNE2-SC 3周内即能成瘤，成瘤率33．3％，而CNE2-MN不能成瘤，1×105个CNE2-SC与CNE2-MN成瘤体积比为（1．750±0．613）cm3 vs （0．457±0．291）cm3（P＜0．05），而1×106个以上2种细胞成瘤体积比为（2．332±0．549）cm3 vs （0．669±0．278）cm3（P＜0．01）。结论利用特制SFM悬浮培养法可得到鼻咽癌CNE2-SC，这种微球体富集了肿瘤干细胞，将为后续鼻咽癌干细胞研究打下基础。