RAGE在高迁移率族蛋白B1调控CD4+T细胞Th1/Th2功能性分化中的作用

目的 探讨晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)在高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)介导CD4+T细胞Th1/Th2功能性分化中的作用.方法 体外分离、培养小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,将细胞浓度调整为2× 106/L,接种至96孔培养板,0.2 mL/孔,预先加入终浓度为3μg/L的刀豆素A(ConA)刺激12 h;依据HMGB1刺激剂量随机分成4组:对照组、10 ng/mL组、100 ng/mL组和1 000 ng/mL,分别在HMGB1刺激12h、24 h和48 h时间点,利用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)法检测白介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)表达;根据实验结果,在后期实验中选择1 00 ng/mL HMGB1刺激时间为24 h;将ConA刺激后的细胞细胞随机分成4组:对照组、A组(HMGB1刺激)、B组(HMGB1+PBS刺激)、C组(HMGB1 +RAGE抗体刺激).A、B、C组分别加入PBS稀释的终浓度为100 ng/L HMGB1工作液,对照组加入等容积的PBS液;其中B、C组在HMGB1刺激之前加入PBS液或PBS液1∶200稀释的终浓度为5μg/L RAGE中和抗体孵育2h;分别采用Western-blot和荧光定量PCR法测定RAGE、CATA-3的表达;ELISA法检测白介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)表达,多组之间的数据比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 与对照组(6.07±0.25)比较,100ng/mL HMGB1刺激24 h(4.43±0.17)、48 h(3.67±0.09),IFN-γ/IL-4显著下降(P＜0.05);而与对照组比较(6.34±0.42),10 ng/mL HMGB1刺激24h (7.65±0.19),IFN-γ/IL-4比值显著增加(P＜0.05),而100 ng/mL(5.10±0.19)和1 000 ng/mL HMGB1(3.31±0.12)刺激24 h IFN-γ/IL-4显著下降(P＜0.05);与对照组比较,A组RAGE蛋白和mRNA表达显著升高(P＜0.05);A、B组IFN-γ/IL-4比值(A组5.75±0.27;B组5.66±0.31)较对照组(7.37±0.36)明显降低(P＜0.05),GATA3mRNA显著升高(P＜0.05);而C组IFN-γ/IL-4比值(6.19±0.14)较A组升高(P＜0.05),GATA3 mRNA下降(P＜0.05),A组与B组比较差异无统计学意义(P＞0.05);与A组比较,B组RAGE的表达差异无统计学意义(P＞0.05),C组明显降低(P＜0.05),而C组较对照组RAGE的表达仍有明显增加(P＜0.05).结论 HMGB1体外介导的CD4+T淋巴细胞向Th2功能性分化至少部分是通过过度活化RAGE/GATA3途径来实现的.