FAT10真核质粒的构建、转染及其蛋白的表达

目的 构建类泛素基因FAT10的真核表达质粒,观察其蛋白在转染人胚肾细胞系293T中的表达.方法 采用RT-PCR法扩增FAT10全长基因片段后,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FAT10克隆至pcDNA5-FRT表达载体并行酶切鉴定;用脂质体LipofectamineTM2000分别介导空质粒(空载组)及重组质粒(FAT10质粒组)转染293T细胞,以脂质体混合PBS(PBS组)及未加入脂质体(未转染组)作为对照.转染48 h后,收集细胞.采用Western blot法检测293T 细胞中的FAT10蛋白.结果 pMD18-FAT10重组质粒经双酶切获得498 bp片段,对PCR产物及498 bp片段进行测序,结果与GenBank报道序列完全一致.FAT10质粒组、未转染组、空载体组和PBS组FAT10蛋白表达量分别为1.556±0.072、0.334±0.051、0.425±0.095、0.382±0.063,FAT10质粒组与未转染组、空载体组和PBS组比较,P均<0.05.结论 成功构建了FAT10的真核表达质粒pcDNA5-FRT-FAT10,FAT10蛋白在293T细胞中高表达.