压力诱导兔视网膜干细胞向视网膜神经节细胞分化研究
Chinese Journal of Experimental Ophthalmology(2022)
摘要
目的:探讨压力对与兔视网膜神经节细胞(RGCs)共培养的视网膜干细胞(RSCs)分化的影响。方法:选取SPF级新西兰孕22 d兔,取出胚胎,获取视网膜睫状缘色素上皮组织,培养原代RSCs。选取SPF级新生新西兰大白兔6只,分离视网膜神经上皮层组织,培养原代RGCs。采用巢蛋白(Nestin)抗体免疫荧光染色法、溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)流式细胞术分析、RSCs自发分化细胞免疫荧光检测及流式细胞术分析鉴定体外培养的兔RSCs,采用免疫荧光染色法以Brn3b抗体及Thy1.1抗体鉴定RGCs;将RGCs和RSCs分别放在Transwell的上下层培养,构建共培养体系。分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测0、20、40、60、80 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)压力条件下室RSCs及分化所得细胞的Nestin和Thy1.1 mRNA和蛋白表达变化。结果:体外培养的兔RSCs特异性标志物Nestin抗体染色阳性;BrdU流式细胞术分析结果显示,BrdU阳性细胞占分离RSCs细胞的(92.26±3.28)%;免疫荧光检测结果显示,RSCs分化细胞中,部分细胞Brn3b抗体表达阳性,部分细胞GS抗体表达阳性。流式细胞术双色分析结果显示,Brn3b和GS阳性细胞率分别为(13.00±3.06)%和(31.60±3.67)%。免疫荧光染色结果显示,体外培养的兔RGCs Brn3b抗体及Thy1.1抗体染色阳性。不同压力条件下RSCs及分化所得细胞的Nestin、Thy1.1 mRNA和蛋白相对表达量比较差异均有统计学意义(mRNA: F=127.600、137.400,均 P<0.01;蛋白: F=82.480、158.700,均 P<0.001),其中与0 mmHg相比,20、40、60、80 mmHg条件下,Nestin mRNA及蛋白相对表达量降低,Thy1.1 mRNA及蛋白相对表达量增加,差异均有统计学意义(均 P<0.05)。40 mmHg时,Nestin mRNA和蛋白相对表达量最低,Thy1.1 mRNA和蛋白相对表达量最高。 结论:在一定范围内,压力能够促进与RGCs共培养的RSCs分化成视网膜神经节样细胞,压力过大会抑制RSCs的分化。
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关键词
Retina,Stem cells,Retinal ganglion cells,Pressure,Cell differentiation,Glaucoma
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