汉滩病毒PS-6单克隆抗体的制备及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用

目的 制备汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)PS-6株小鼠单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),建立HT-NV抗原双抗体夹心ELISA检测方法,验证方法的检测性能并初步应用于疫苗抗原含量检测.方法 以HTNV PS-6株灭活全病毒原液作为免疫原,采用小鼠杂交瘤融合技术,筛选mAb杂交瘤细胞株,制备mAb;用间接ELISA测定mAb效价;用Western blot鉴定mAb特异性;用间接ELISA测定mAb相对亲和力;经抗体配对筛选,建立双抗体夹心ELISA病毒抗原检测方法.以Ⅰ型肾综合征出血热疫苗标准品作为定量标准,验证该方法的检测限、线性范围、特异性、准确度、精密度;对6批次Ⅰ型肾综合征出血热灭活疫苗原液进行检测,初步验证该方法的适用性.结果 获得4株稳定分泌抗HTNV PS-6特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株:4B2、3H8、5D7及2A7;间接ELISA检测腹水抗体效价均在1×106～1×107;Western blot鉴定4株mAb均能特异性识别HTNV PS-6;相对亲和力为4B2＞5D7＞3H8＞2A7;抗体ELISA配对筛选后,选用5D7作为包被抗体,4B2作为标记抗体,包被抗体工作浓度为10 μg/mL,HRP标记抗体工作浓度为1 ∶ 5 000.该方法对HTNV PS-6抗原检测限为0.039 1 μg/mL;检测线性范围为0.078 1～2.500 0 μg/mL,R2＞0.97;检测与Ⅰ型肾综合征出血热疫苗生产主要原辅料成分、Ⅱ型肾综合征出血热疫苗、森林脑炎疫苗及甲肝疫苗均无交叉反应;准确度验证,病毒抗原回收率在95.8％～110.5％之间;试验内和试验间精密度,CV分别在6.72％～8.03％、8.24％～9.70％之间.用该方法检测6批次1型肾综合征出血热灭活疫苗原液,结果均呈剂量依赖性.结论 成功制备HTNV PS-6株mAb,建立病毒抗原双抗体夹心ELISA抗原检测方法,方法准确、可靠,可初步应用于Ⅰ型肾综合征出血热灭活疫苗科研、生产过程病毒抗原检测.