分子信标荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的反应体系优化方法对比研究

目的 建立分子信标荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的最佳反应体系,探讨影响分子信标荧光定量PCR扩增结果的多个因素.方法 利用单因素法和正交实验法,从MgCl2,引物,分子信标探针,dNTP,Taq DNA聚合酶5种因素对分子信标荧光定量PCR反应体系进行优化,并对这两种方法所得的最优体系进行比较.结果 单因素法得到的最优反应体系(25 μl)为:4 mmol/L MgCl2,上、下游引物各0.3 μmol/L,分子信标探针0.1 μmol/L,200 μmol/L dNTP,2U Taq DNA;正交法得到的最优反应体系(25 μl)为:6 mmol/L MgCl2,上、下游引物各0.2 μmol/L,分子信标探针0.1 μmol/L,100 μmol/L dNTP,3U Taq DNA聚合酶,正交法得到的最优反应体系的荧光定量PCR扩增曲线形状更好,Ct值较小,△Rn较大.结论 采用正交法得到的荧光定量PCR反应体系优于单因素法,进行实时荧光定量PCR反应体系优化时,正交实验设计是一条科学、可靠、高效、快捷的途径.