胃乙醇脱氢酶δδ-ADH的原核表达及酶学性质

为获得人胃乙醇脱氢酶δδ-ADH,根据GeneBank中δδ-ADH的基因序列合成目的基因ADH7,构建重组表达载体pET-32a(+)-ADH7,并转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3).获得的阳性转化子经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,目的蛋白质以包涵体的形式得到大量表达.用1 mol/L尿素溶解包涵体获得有活性的粗酶液,经HisTrapTMexcel亲和层析柱纯化获得目的蛋白质,检测δδ-ADH酶活并对其基本酶学性质进行研究.结果 显示,δδ-ADH的活性为2.085 U/mg,Km为28.43 mmol/L,Vmax为316.46 μmol/(L·min).δδ-ADH的最适反应温度为40℃,在30～50℃范围内温浴60 min,相对酶活在47％以上;最适pH为9.0,将δδ-ADH在不同pH(pH 3.0～11.0)的广泛缓冲液中于25℃保温30 min,在pH 6.0～11.0范围内酶活较稳定.pH 5.0时,相对酶活剩余60％;在0、500、1 000、1 500 mmol/L乙醇中37℃温浴30 min,相对酶活分别为65.6％、51.1％、45.4％和44.4％.