基于Keima荧光蛋白的线粒体自噬评价体系的建立

目的:探讨建立一种基于Keima荧光蛋白评价线粒体自噬的体系.方法:由于Keima蛋白具有在酸性和中性pH中荧光信号不同的特性,因此定位于线粒体的Keima (mt-Keima)可显示通过自噬途径进入溶酶体中的线粒体,以此可以直观反映线粒体自噬的程度.构建定位于线粒体的Keima (mt-Keima)稳定表达载体,利用慢病毒感染的方式获得稳定表达细胞系.以CCCP刺激诱导线粒体自噬,观察刺激0～8 h 440 nm通道(指示中性pH下的Keima)和586 nm通道(指示酸性pH下的Keima)激发荧光信号的变化.结果:电泳结果显示mt-Keima基因片段扩增成功,酶切质粒鉴定结果显示重组质粒构建成功.不同pH条件下440 nm和586 nm激发光激发出的荧光信号不同,表明Keima蛋白表达正常并能够指示酸碱变化.在线粒体自噬诱导剂CCCP刺激下,细胞的酸性荧光信号随刺激时间逐步增加,表明线粒体自噬程度逐渐增强.结论:构建的体系能够准确评价线粒体自噬,为进一步探讨线粒体自噬机制提供了实验基础.