微RNA-221诱导PC-9肺癌细胞对吉非替尼的耐药机制

目的 探讨微RNA(miR)-221诱导PC-9肺癌细胞对吉非替尼的耐药机制.方法 应用慢病毒空载对照(LV-NC)和LV-miR-221转染PC-9细胞并建立细胞稳转株PC-9/NC和PC-9/miR-221.荧光定量PCR法检测稳转细胞株中miR-221的相对表达量;细胞计数试剂盒(CCK-8法)检测吉非替尼(0～4 μmol/L)对细胞生长增殖的影响;流式细胞术检测吉非替尼对细胞凋亡的影响;荧光定量PCR法和免疫荧光法检测凋亡酶激活因子-1(APAF-1) mRNA和APAF-1蛋白相对表达量;双荧光素酶报告基因实验检测APAF-1与miR-221的关系;Western印迹检测表皮生长因子受体(EGFR)及其磷酸化(p-EGFR)和APAF-1、剪切的半胱氨酸/天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved-caspase-3)蛋白相对表达量.结果 PC-9/NC细胞中miR-221的相对表达量显著低于PC-9/miR-221细胞[(1.00±0.082)比(40.24±0.017)] (P＜0.01);PC-9/NC细胞半数抑制浓度(IC50)显著低于PC-9/miR-221细胞[(IC50 =0.1 μmol/L)比(IC5o ＞4 μmol/L)](P＜0.05);PC-9/NC细胞凋亡率显著高于PC-9/miR-221细胞[(33.42±4.28)％比(10.27±1.12)％](P＜0.05);PC-9/NC细胞中APAF-1 mRNA的表达量显著高于PC-9/miR-221细胞中[(1.000+0.069)比(0.701±0.072)] (P ＜0.05),PC-9/NC细胞中APAF-1蛋白的相对表达量明显高于PC-9/miR-221细胞.共转染荧光素酶质粒pmir-REPORT-APAF-1-wt和miR-221a模拟物后,miR-221a抑制荧光素酶活性显著高于转染miRNA阴性对照组(P＜0.01);吉非替尼均可下调PC-9/NC和PC-9/miR-221细胞中的p-EGFR,PC-9/miR-221细胞中APAF-1、Cleaved-caspase-3蛋白明显低于PC-9/NC细胞,吉非替尼上调PC-9/NC细胞中的APAF-1、Cleaved-caspase-3等促凋亡蛋白表达水平显著高于PC-9/miR-221细胞(P＜0.05).结论 miR-221可能通过下调APAF-1的表达诱导PC-9细胞对吉非替尼耐药.