百合三种主要病毒的RT-PCR检测及脱毒技术研究

百合病毒病是影响百合切花和种球产量与质量的关键问题之一,虽然在我国百合病毒检测和脱毒技术的研究已经展开,但是在病毒检测中存在着检测病毒的种类较单一和检测结果出现假阴性等问题；脱毒方面也存在操作难度大、脱毒率不高等缺陷.本研究以麝香百合杂种系品种雷山一号(Lilium longiflorum cv.Raizan l)组培苗为试材,对侵染百合的3种主要病毒:黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、百合无症病毒(Lily symptomless virus,LSV)和百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的多重RT-PCR检测及病毒脱除技术进行了研究.根据百合18S rRNA和3种病毒的基因序列,设计了4对特异引物,并对多重RT-PCR中的dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶浓度、退火温度和反应循环数等因素进行了筛选和优化.结果表明,进行多重RT-PCR的最佳反应体系为:dNTPs(2.5 mmol/L) 1.5 μL,Mg2+(25 mmol/L) 1.5 μL,Buffer 1.875 μL,cDNA 1 μL,CMV、LMoV、LSV、18S上、下游引物各0.5 μL,TaqDNA聚合酶0.2 μL,加H2O补足至25 μL.最佳反应程序为:94℃预变性5 min; 94℃变性30s,52.4℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环；72℃延伸10 min,4℃终止反应.由此建立了以百合18S rRNA为内参照,同时检测CMV、LSV和LMoV的多重RT-PCR技术.黑暗、变温热处理结合试管鳞茎培养只对脱除百合植株CMV有效,脱毒率达90％以上；黑暗、变温热处理后,切取≤1 mm的茎尖进行光培养能够有效脱除CMV、LSV和LMoV 3种病毒,脱毒率达到93.3％.此脱毒方法具有操作简便、培养周期较短、脱毒率高等优点,可以为百合脱毒苗的生产提供指导.