牛妊娠相关糖蛋白18重组载体构建、表达条件优化和生物信息学分析

为了制备牛妊娠相关糖蛋白18(boPAG18),并预测其理化性质和功能,本试验优化密码子并合成boPAG18 基因,构建pET30a-boPAG18 重组质粒.以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的蛋白质表达量为指标,优化装液量、诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度条件,采用亲和层析法纯化boPAG18,SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定.预测boPAG18 的疏水性、信号肽、修饰位点、结构和蛋白相互作用.结果显示,经双酶切鉴定,pET30a-boPAG18 重组质粒构建成功,boPAG18 基因1 143 bp,表达蛋白约38 kDa.确定最佳表达条件为在OD600 nm值为0.6,装液量为40 mL,IPTG终浓度为0.2 g/L,37℃诱导4h.纯化的boPAG18 纯度高达98%,浓度为2.63 mg/mL.该蛋白分子式为C1923 H3007 N519 O541 S17,分子质量为42.6 ku,等电点为9.31,亲水性平均值为-0.041,为两性蛋白,蛋白质不稳定指数为 42.41,在水中不稳定;脂肪系数为 88.43,有 381 个氨基酸;消光系数为47 370 mol-1·cm-1,半衰期为30 h.boPAG18 前15 个氨基酸为信号肽,无跨膜区域;有糖基化修饰位点57 个,磷酸化修饰位点68 个,B细胞抗原表位13 个,二级结构中α-螺旋占比19.42%、β-转角占比5.77%、无规则卷曲占比44.88%、延伸链占比29.92%;有7 个相互作用蛋白,可能参与了母体在妊娠期的泌乳、抗菌和神经保护等调节功能.本试验为深入研究boPAG18 的结构和功能提供了数据支持.