红丽海棠茎尖超低温保存技术研究

[目的]建立红丽海棠超低温保存技术体系,实现其种质资源保存.[方法]以红丽海棠茎尖为试材,研究蔗糖预处理浓度和时间、装载处理时间、PVS2处理时间对其超低温保存后的存活率的影响,并在此基础上,在超低温保存程序中的不同环节添加 3种抗氧化剂[过氧化氢酶(Catalase,CAT)、抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)]和 2种细胞程序性死亡(PCD)抑制剂[(乙烯利Ethephon,Eth)和NO供体(Sodium Nitroprusside,SNP)],探讨其对茎尖冻后存活率的影响.[结果](1)红丽海棠茎尖的玻璃化保存程序为:首先将红丽组培苗切为 4～5 mm带顶芽茎段,接种在含 0.7 mol·L?1 蔗糖的预培养基后放入 4℃冰箱冷锻炼 2d;再将其切成约 1.5～2.0 mm的茎尖,置于Loading溶液中,在室温下处理 20 min,随后于 0℃下PVS2溶液处理 90 min,立即投入液氮冻存;需用时将其从液氮罐取出后,快速放入 38℃水浴中化冻 1 min,再用Unloading溶液在室温下震荡洗涤 2次,每次 10 min.采用此方法红丽海棠茎尖液氮冻后存活率为 66.58%,恢复生长率为 16.67%.(2)不同浓度的外源添加剂对红丽海棠冻后存活率影响不同.其中,CAT、AsA和GSH最佳添加浓度分别为 200 U·ml?1、400 μmol·L?1 和 0.04 μmol·L?1,较对照冻后存活率分别提高了 20.28%、6.75%和 27.61%,添加Eth和SNP没有显示明显的正向作用.[结论]红丽海棠茎尖可以实现超低温保存,外源添加适宜浓度GSH、CAT、AsA可以提高液氮冻存后率,效果最好的GSH可将恢复生长率从16.67%提高到41.39%.