猫等孢球虫荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速、准确检测猫等孢球虫的方法,本研究采用GenBank登录的猫等孢球虫18srRNA基因序列(L76471.1)保守区设计并合成1对特异引物,从经显微镜检测为猫等孢球虫阳性的粪便样品中选取一份提取猫等孢球虫DNA,以其为模板经PCR扩增猫等孢球虫18s rRNA基因片段,构建重组质粒标准品pUCm-T-IF1并经PCR及测序鉴定正确后作为质粒标准品.通过优化反应条件,建立了猫等孢球虫的荧光定量PCR检测方法.特异性试验结果显示,该方法可以特异性的检测猫等孢球虫DNA,对猫贾第虫、猫滴虫、猫细小病毒、猫冠状病毒DNA/cDNA的检测结果均为阴性;对重组质粒标准品的检测限可达6.26×102拷贝/μL.批内和批间重复性试验的变异系数分别是0.61％～2.06％和0.32％～0.50％.表明本研究建立的方法特异性强、敏感性高、重复性好.利用该方法对23份临床疑似猫等孢球虫感染的样品进行检测,荧光定量PCR的检出率为78.26％(18/23),明显高于漂浮法检测的阳性率43.48％(10/23),并且经漂浮法检测为阳性的样品采用该方法检测均为阳性.结果表明,本研究建立的荧光定量PCR方法能够更准确的检测猫等孢球虫的感染,为开展猫等孢球虫病和流行病学调查提供更准确的检测手段.