STAT3纳米抗体的制备与功能鉴定

[目的]获得抗信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)蛋白的特异性纳米抗体,通过验证该纳米抗体在免疫组织化学和Western blotting检测中的应用及对黑色素瘤细胞B16生长的作用,对其功能进行鉴定.[方法]通过噬菌体展示淘筛技术从羊驼B16纳米抗体文库中筛选抗STAT3纳米抗体,获得阳性克隆并测序;根据序列信息设计和构建pColdⅠ原核表达质粒,并通过大肠杆菌进行纳米抗体表达;通过镍柱、分子筛和超滤管进行纯化和浓缩;利用免疫组织化学和Western blotting验证纳米抗体是否结合脑组织中STAT3蛋白;采用CCK8法分析该纳米抗体对B16细胞增殖的影响,并用Western blotting检测其对其分子路径相关基因表达的影响.[结果]经过噬菌体展示淘筛及阳性克隆测序后,成功获得1株特异性结合STAT3蛋白的纳米抗体单克隆菌株,命名为STAT3-VHH-10B;将构建的该纳米抗体的pColdⅠ原核表达载体进行诱导表达和纯化,SDS-PAGE结果显示,成功得到大小约为15 ku的抗STAT3纳米抗体;免疫组织化学和Western blotting结果显示,纯化制备的纳米抗体可成功检测到大脑组织中STAT3的表达;细胞增殖检测结果显示,该纳米抗体对B16细胞增殖具有明显的抑制作用,并下调细胞增殖路径的主要基因CycD1、Bcl2、cMyc编码蛋白的表达.[结论]本研究成功筛选到1株抗STAT3蛋白的特异性纳米抗体,且该纳米抗体可用于免疫组织化学和Western blotting法检测组织中STAT3的表达,此外,通过与抗原结合后,抑制主要基因CycD1、Bcl2、cMyc的表达,从而抑制B16细胞增殖.本研究结果将为STAT3及其纳米抗体的功能研究提供新工具.