布鲁氏菌重组L7/L12蛋白对小鼠免疫保护效果的评价

为探究布鲁氏菌候选保护性抗原L7/L12的免疫原性及其对小鼠的免疫保护效果,本研究经PCR扩增羊种布鲁氏菌16M株L7/L12基因,构建重组质粒pET-22b-L7/L12,经双酶切鉴定正确后转化E.coli BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达并纯化后利用SDS-PAGE与western blot检测.结果显示,获得了 16 ku的重组L7/L12蛋白(rL7/L12),且纯化效果较好.将rL7/L12以100μg/只腹腔注射免疫6周龄SPFBALB/c小鼠,14d后以50 μg/只加强免疫.首免后7d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d及49 d分别对所有小鼠尾静脉采血,通过间接ELISA方法检测小鼠血清中的IgG抗体、其亚型(IgG1、IgG2a)抗体水平及二者比值;并利用ELISA方法检测首免后21d和35 d两组小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-10和TNF-α的分泌水平.结果显示,首免后14 d,小鼠血清中IgG抗体水平迅速升高,于首免后21d达峰值并持续至首免后49 d(P＜0.01),对照组小鼠则一直无抗体产生;首免后14d,rL7/L12组小鼠血清中的IgG1抗体水平极显著高于IgG2a抗体水平(P＜0.01),且IgG1/IgG2a大于1;但首免后42 d,rL7/L12组小鼠血清中IgG2a抗体水平极显著高于IgG1(P＜0.01),IgG2a/IgG1比值大于1.表明在免疫前期,rL7/L12主要诱导小鼠的Th2型体液免疫反应,免疫后期主要诱导小鼠Th1型细胞免疫反应.首免后21d和35 d,rL7/L12组小鼠IL-2和TNF-α含量极显著高于PBS对照组(P＜0.01),首免后35 d,该组小鼠抑炎因子IL-10的含量极显著低于PBS对照组(P＜0.01).首免后21d和35d,分别剖杀每组小鼠,分离小鼠脾淋巴细胞,利用ELISpot法检测各组小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ的分泌水平.结果显示,首免后21 d,rL7/L12组小鼠脾淋巴细胞IFN-γ的分泌水平有所升高,但与PBS对照组无显著差异(P＞0.05);但免疫后35d,rL7/L12组小鼠脾淋巴细胞IFN-y分泌水平显著高于PBS对照组(P＜0.05).上述结果表明,rL7/L12免疫后期刺激小鼠机体产生Th1型细胞免疫反应,与抗体检测结果相符.首免后42 d通过腹腔注射途径以100 μL(含1x105 cfu/只)的羊种布鲁氏菌新疆流行株043攻击小鼠,攻毒后观察死亡情况,15 d后剖杀全部小鼠,通过检测其脾脏指数及脾脏载菌量(cfu)评价rL7/L12对小鼠的保护效果,结果显示,攻毒后15 dPBS对照组小鼠精神沉郁,但两组小鼠均无死亡;rL7/L12组小鼠的脾指数和脾脏载菌量均显著低于PBS对照组(P＜0.05).本研究结果首次表明,rL7/L12免疫小鼠后能够刺激小鼠的Th2型体液免疫反应和Th1型细胞免疫反应,且以Th1型细胞免疫反应为主.本研究为布鲁氏菌L7/L12亚单位疫苗的研发奠定了基础.